凝胶迁移实验(EMSA)原理及步骤

        一、凝胶迁移实验(EMSA)原理

　　凝胶迁移实验是一种研究 DNA 与蛋白质或 RNA 与蛋白质相互作用的常用技术，这项技术是基于 DNA 蛋白质或 RNA 蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有不同迁移率的原理。近年来，EMSA 已发展成为体外研究核酸，尤其是 DNA 与蛋白质相互作用的一种简单，迅速，而灵敏的方法，已成为了转录因子与核酸体外相互作用的经典方法。

　　二、凝胶迁移实验(EMSA)所需材料

　　1、实验材料：

　　DNA样品

　　2、试剂、试剂盒：

　　[γ-32P]ATP、T4多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4多聚核苷酸激酶缓冲液、醋酸铵、TE、无水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、过硫酸铵、TEMED(四甲基乙二胺)、EMSA Gel-Shift结合缓冲液、溴酚蓝。

　　3、仪器、耗材：

　　水浴锅、PCR仪、离心机、电泳仪、电泳槽

　　三、凝胶迁移实验(EMSA)步骤

　　(一)探针的标记：

　　1. 如下设置探针标记的反应体系：

　　(1)待标记探针 (1.75 pmol/微升) ：2微升。

　　(2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。

　　(3)Nuclease-Free Water ：5微升。

　　(4)[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。

　　(5)T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。

　　(6)总体积 10微升

　　(7)按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。

　　2. 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。

　　3. 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。

　　4. 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。

　　5. 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。

　　(二) 探针的纯化

　　通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作：

　　1. 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。

　　2. 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。

　　3. 在4℃，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。

　　4. 在4℃，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。

　　5. 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。

　　(三)EMSA 胶的配制

　　1. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。

　　2. 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。

　　(1)TBE buffer (10X)： 1毫升。

　　重蒸水 16.2毫升。

　　(2)39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。

　　(3)80% 甘油： 625微升。

　　(4)10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) ：150微升。

　　(5)TEMED ：10微升

　　3. 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

　　(四)EMSA结合反应

　　1. 如下设置EMSA结合反应

　　阴性对照反应：

　　(1)Nuclease-Free Water ：7微升。

　　(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。

　　(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0微升。

　　(4)标记好的探针 ：1微升。

　　(5)总体积 ：10微升。

　　样品反应：

　　(1)Nuclease-Free Water ：5微升。

　　(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。

　　(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。

　　(4)标记好的探针： 1微升。

　　(5)总体积： 10微升。

　　探针冷竞争反应：

　　(1)Nuclease-Free Water ：4微升。

　　(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。

　　(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2微升。

　　(4)未标记的探针： 1微升。

　　(5)标记好的探针： 1微升。

　　(6)总体积 ：10微升。

　　突变探针的冷竞争反应：

　　(1)Nuclease-Free Water ：4微升。

　　(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。

　　(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。

　　(4)未标记的突变探针： 1微升。

　　(5)标记好的探针： 1微升。

　　(6)体积 ：10微升

　　Super-shift反应：

　　(1)Nuclease-Free Water：4微升。

　　(2)EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。

　　(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。

　　(4)目的蛋白特异抗体 ：1微升。

　　(5)标记好的探针：1微升。

　　(6)总体积 ：10微升。

　　2. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。

　　3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。

　　(五) 电泳分析

　　1. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。

　　2. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色)，用于观察电泳进行的情况。

　　3. 按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。

　　4. 剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。

　　5. 干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。

　　四、凝胶迁移实验(EMSA)注意事项

　　1.通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。

　　2.DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。

　　3.同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。

　　4.当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。

　　5.在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。

　　6.竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异)，和其它非相关的片段(非特异)，来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。