酶联免疫吸附测定(ELISA)实验流程

        酶联接免疫吸附测定,Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ，简称ELISA，是以免疫学反应为基础，将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。自上世纪70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛应用于生物学、医学的许多领域。根据检测时标本以及检测目的等的不同，具体可以设计出不同类型的ELISA 方法，如间接法、双抗夹心法、双位点一步法、竞争结合等。

　　本文以检测待测标本中肿瘤坏死因子TNFα的含量介绍双抗体夹心ELISA 法。其基本原理是：抗人TNFα单克隆抗体被固相化在酶标板上，所加入标本中的抗原TNFα被酶标板上的单克隆抗体所捕获，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的抗原;被捕获的TNFα再与加入的生物素化的抗人TNFα二抗结合，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的二抗;生物素再与加入的亲和素-HRP结合，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的亲和素-HRP，HRP与最后加入的底物反应，形成有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

　　一、实验前准备

　　1、实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材：

　　TNFα的ELISA检测试剂盒为：Human Tumor Necrosis Factor α ELISA Kit。此试剂盒中包含了实验所需的所有主要试剂。

　　2、主要仪器和耗材有：

　　Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪、芬兰百得的各个量程单通道移液器，赛默飞公司的QSP盒装吸头及冰盒等。

　　二、实验流程

　　本实验操作流程是：样品的稀释;样品与捕获抗体的孵育;洗涤;二抗孵育;洗涤;亲和素-HRP 孵育;洗涤;底物显色;OD 值的检测;标准曲线的绘制与标本中 TNFα 浓度的计算。

　　1、样品稀释

　　(1)预先将冻干的人 TNFα 标准品溶解在适量超纯水中，溶解成浓度为2000pg/ml 母液。

　　(2)取8只1.5ml离心管，做好浓度标记，分别是：1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、0pg/ml。分别吸取200μl的样品稀释液至8个离心管中，取200μl的标准品母液至第1个离心管中，漩涡混匀后吸取200μl至第2个离心管中，同样漩涡混匀后吸取200μl至第3个离心管中，依次稀释至第7个离心管，最后一个标记为零的离心管不含标准品，作为空白对照。

　　2、免疫反应

　　(1)实验中所用到的试剂均需预先从冰箱中取出，室温恢复至常温。

　　(2)按每孔50μl往已包被了人TNFα单抗的酶标板中加入各组样品，每组样品2至3个复孔，首先加入1个空白对照样、然后是7个浓度的标准品、最后是两个稀释倍数的待测样品。加完后轻轻拍打酶标板数次混匀。注意：标准品按浓度梯度依次加样，并且做好各个样品的标记。

　　(3)用盖板膜小心盖好酶标板，确保所有的边缘已密封好，室温孵育 1h。

　　(4)孵育结束后，小心去除板盖膜，吸去板内液体，用 Plate Washing 洗涤酶标板 3 次，将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。

　　(5)按每孔100μl加入已稀释好的生物素标记TNFα二抗。

　　(6)盖板膜小心盖好酶标板，确保所有的边缘已密封好，室温孵育 1h。

　　(7)孵育结束后，小心去除板盖膜，吸去板内液体，用 Plate Washing 洗涤酶标板 3 次。将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。

　　(8)按每孔 100μl 加入亲和素-HRP，盖板膜小心盖好酶标板，室温避光孵育30min。

　　(9)孵育结束后，小心去除板盖膜，去除板内液体，用 Plate Washing 洗涤酶标板 3 次。将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。

　　(10)按每孔 100μl 加入 TMB 显色底物，室温避光反应 30min。

　　(11)30min后，每孔加入100μl Stop Solution终止反应，终止后孔内液体呈现橙黄色。

　　(12)终止后于波长492nm处立即进行OD值的检测。

　　3、吸光值测定：

　　(1)打开Thermo Scientific Skanlt Software软件，点击“New session”新建程序，给程序命名后，点击“Next”;

　　(2)根据所用的酶标板型号选择微孔板的类型，点击“Next”;

　　(3)点击“Finish”进行程序编辑界面;

　　(4)选中“Plate layout”，点击右上角“wizard” 进入填充向导界面;先填充空白对照,“Type”选择Blank，No.of calibrators与No.of replicates分别选择1和2，根据样品的浓度梯度和复孔方向选择箭头方向;

　　(5)点击“Add”添加下一组样品，按相同的方法分别填充标准品和待测样品。

　　(6)填充完样品后，点击“close”关闭填充界面。

　　(7)点击已填充的标准品的孔，分别输入相应的浓度值;

　　(8)点击“Protocol”，选中左边“吸收光波长”图标，在参数栏中把波长设置为492nm;保存设置后;

　　(9)点击“connect”,待连接后点击“三角形”开始键，选择刚才设置的程序后点击“ok”即开始读数，显示结果后，点击程序名下的“Photometric”键， 再点击左边的“Quantitative Curve”键，点击右上边的“Graph”即得到标准曲线和相关参数方程。

　　4、结果分析

　　查看不同稀释度下待测样品的 OD 值，选取一个 OD 值位于标准曲线 OD 值范围内的结果代入方程，所得结果再乘以稀释倍数即得到被检样品中 TNFα 的含量。