医学实验方法总结(5)：分子机制—核酸检测

　　上一篇中给大家已经介绍了关于蛋白检测的实验方法总结，这次小编给大家带来的是关于核酸检测的实验方法。核酸检测是直接对动植物有害生物基因序列和结构进行测定。

　　一、核酸检测技术

　　核酸的分离纯化、PCR技术、核酸杂交技术

　　二、PCR技术

　　实验概述：

　　Real-Time PCR 技术，又称实时定量荧光PCR(real-time quantitative PCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。

　　实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。Real-Time PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。常用方法：SYBR green(荧光染料掺入法) 和Taqman probe (探针法)。

　　实验目的：

　　用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。

　　实验原理：

　　1.SYBR green(非特异性荧光标记):

　　在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

　　2.Taqman Probe(特异性荧光标记):

　　PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

　　实验步骤：

　　1. RNA抽提(以细胞样品为例，操作步骤同RT-PCR)

　　1.1弃去培液，PBS洗2遍，加入1ml Trizol，轻轻吹打，直至细胞脱落，吸入1.5 ml EP管内，静置5 min。(Trizol量根据细胞密度可适当调整，建议：6孔板细胞长满~1ml Trizol)

　　1.2 加入200μl氯仿(三氯甲烷)，用手剧烈震荡15秒，室温静置2-3分钟。(氯仿量为1/5 Trizol)

　　1.3 12000g，4℃，离心15min。

　　1.4 仔细转移上层水相到1个新EP管中，不能贪多，约400-500μl。

　　1.5加等体积异丙醇，轻柔混合4～5次，室温放置10分钟。

　　1.6 12000g，4℃，离心10min。

　　1.7轻轻倒去上清，用20 μl枪轻轻吸去残液，沉淀用1ml 75%乙醇(0.75ml无水乙醇+0.25ml DEPC水，现配)洗1～2次，涡旋混匀。

　　1.8吸去上清，5-10分钟空气干燥RNA。(肉眼不能明显看到水分即可)

　　1.9加15-20μl DEPC水，吹打数次，测浓度。

　　注释：mRNA不稳定，很容易讲解，因此mRNA提取过程中要尽量避免RNA酶污染。

　　2. 反转录(参照商品化试剂盒说明书)

　　3. 定量PCR实验(具体参数设置请参照商品化试剂盒说明书)

　　(1)PCR reaction mix的制备 (在冰上操作);

　　(2)将8联管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部;

　　(3)PCR 反应，采用了标准的三步法程序进行反应

　　(4)在PCR 反应后，进行熔解曲线分析

　　4. 定量PCR数据分析

　　(1)定量PCR 试验原始数据

　　(2)内参基因在不同样本中的数据分析

　　(3)目的基因表达量分析

　　(4)表达差异的计算

　　以上的信息就是关于核酸检测的实验方法之一的相关介绍了，其他核酸检测的方法详情可见附件中，大家可通过以下方式获取：

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