实验设计方案套路8-干细胞功能研究型

前面已经介绍了7种实验设计方案套路，今天为科研朋友介绍最后一种，以干细胞功能研究型实验设计方案《METTL3 介导的m6A 甲基化影响前列腺癌肿瘤干细胞特性的机制研究》为范例，希望可以帮到正在写实验设计方案的朋友，预祝科研朋友们一切顺利!

　　METTL3 介导的m6A 甲基化影响前列腺癌肿瘤干细胞特性的机制研究

　　1.1 前列腺癌(Prostate cancer, PC)与 m6A 修饰

　　PC 是一种常见的男性泌尿系统肿瘤，发病率位于男性所有恶性肿瘤的第二位，我国的 PC 患者便占据了很大的比例，且呈逐年上升的趋势。PC 早期治疗措施主要包括：根治性切除术、雄激素阻断治疗和放射治疗等。随着医学的发展，更多 PC 患者和医生倾向于手术治疗，但近年来的研究也对这些积极的治疗措施在延长患者寿命方面的价值提出了质疑[1]。此外，雄激素阻断治疗是当前公认较好的 PC 治疗手段之一，其治疗初期效果明显，然而一段时间的治疗有效期后，几乎所有的患者均进展为去势抵抗性 PC，并伴有骨转移，最终导致治疗失败[2, 3]。总的来说，目前迫切地需要去探究新的治疗靶点，这对于 PC 患者的意义十分重大。

　　PC 的发生发展是一个多步骤的过程，涉及基因、表观遗传学和转录变化之间复杂的相互作用。最近全基因组测序和外显子测序对 PC 中突变情况进行了分析，发现了很多新的突变驱动[4]。值得注意的是，表观遗传调控是最常见的异常途径之一，这可能导致基因的表达发生显著变化，从而促进了 PC 的发生发展。

　　表观遗传调控是指 DNA 和组蛋白上的多种可逆化学修饰，以一种独立于基因组序列的方式调控基因的表达。此外，细胞 RNA(mRNA, tRNA, snRNA 等) 在不同的位点上也有数百个转录后修饰，研究人员已经证明，一些转录后修饰 是可逆的，它们可能具有类似 DNA 和组蛋白修饰的潜在调控功能，且这些可逆的“RNA 表观遗传学”正在成为新的研究前沿[5, 6]。现今，随着高度特异性抗体和高通量测序技术逐渐成熟，人类转录组上不同修饰及其生物学效应的研究已 较为可行[7]。鉴于表观遗传改变对致癌作用的巨大贡献，已不少证据提出，RNA 修饰也可能是癌症进展中表观遗传失调的重要分支[8, 9]。

　　本课题中，我们重点研究了 N-6 甲基腺苷(m6A)修饰，是可以发生在 mRNA、长链非编码 RNA 等 RNA 的腺嘌呤(A)上的甲基化修饰，它也是真核生物的mRNAs 中最常见的化学修饰[10]。m6A 的安装是 m6A“writer”和“eraser”蛋白调节的可逆过程。“writer”即将甲基化修饰“写入”RNA，最常见的分子是Methyltransferase Like 3(METTL3)和 METTL14，两者可在体外和体内催化mRNA 的 m6A 甲基化，Wilms' tumor 1-associating protein(WTAP)是这种甲基转移酶复合体中的另一个关键组分。“eraser”即将 RNA 甲基化修饰信号“擦除”， fat mass- and obesity-associated(FTO)和 AlkB homolog 5(ALKBH5)可以去除 mRNA 上的 m6A 甲基化。此外，还有一个关键的参与者“reader”，即“读取”RNA 甲基化修饰的信息，并参与下游 RNA 的翻译、降解等过程。如具有 YTH Domain Family(YTHDF)结构域的蛋白能够识别并结合 mRNA 中的 m6A，进而减少mRNA 的半衰期促使其降解[11, 12](见图 1)。现有证据表明，m6A 修饰在肿瘤细胞中可影响 mRNA 代谢和翻译等功能，以及在细胞分化、胚胎发育和压力应答等过程中起重要作用。我们在预实验中对 5 组 PC 样本的 mRNA 的 m6A 水平进行了检测，结果显示，相比于正常组，PC 组中 m6A 水平显著升高(见工作基础)。因此我们猜想，m6A 修饰可能在 PC 发生发展过程中扮演着重要的角色， 但是目前对其功能仍不清楚，亟待研究。

　　图 1 m6A 修饰发生过程的示意图

　　1.2 RNA 甲基化酶 METTL3 在 PC 中差异性表达

　　我们在前期研究中，通过 TCGA 数据库对 PC 相关数据进行分析发现，几种 m6A 修饰酶(METTL3、METTL14、WTAP、FTO 和 ALKBH5)中 METTL3上调最为显著。接着在多种人 PC 细胞株和正常细胞中对 METTL3 进行检测发现，METTL3 在 PC 中显著高表达，同时在 DU145 细胞中对 METTL3 敲减后发现，细胞增殖标志物 Ki67 的表达量也显著降低(见工作基础)。由此可见，METTL3 可能在 PC 进程中发挥了重要的作用，尤其与细胞增殖的关系密切，但其作用机制还不明确。

　　METTL3，即甲基转移酶 3，是 m6A 在加工前 mRNA 过程中形成的甲基转移酶复合物的组成成分[13]。查阅文献发现，METTL3 在多种肿瘤中也发挥着重要作用。如 Cai X 等人发现 METTL3 介入 m6A 修饰上调 HBXIP 的表达，并形成了 HBXIP/let-7g/METTL3/HBXIP 反馈回路，最终促进了乳腺癌细胞增殖[14]。同时也有研究表明，在肺癌中 METTL3 将 m6A 位点“写入”mRNA，促进了多个促癌基因的翻译过程，从而影响了肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡[15]。此外，在肝癌、胰腺癌等中也发现了类似结果[16-18]。因此我们合理地提出猜想， 在 PC 中 METTL3 可能通过介入 m6A 修饰，转录后水平上影响了 RNA 的稳定性、定位、运输、剪切和翻译等。

　　以上只截取了一小部分内容，如果想要知道关于《METTL3 介导的m6A 甲基化影响前列腺癌肿瘤干细胞特性的机制研究》完整的实验设计方案内容可以点击这里下载资料包，里面有该实验设计方案的详细分子机制图和技术路线图哦!