实验设计方案套路7-外泌体蛋白/RNA功能研究型

前面已经介绍了6种实验设计方案套路，今天为科研朋友继续介绍一种，以外泌体蛋白/RNA功能研究型实验设计方案《间充质干细胞来源外泌体传递miR-146a对脓毒症血管平滑肌线粒体功能障碍作用机制》为例，介绍如何写实验设计方案，希望可以帮到正在写实验设计方案的朋友。

　　间充质干细胞来源外泌体传递miR-146a对脓毒症血管平滑肌线粒体功能障碍作用机制

　　1. 脓毒症概述

　　脓毒症(Sepsis)是指由真菌、细菌或病毒感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，目前，脓毒症及其引发的多器官功能障碍综合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)是引起 ICU 患者病死的主要原因之一，美国每年大约有 215000 例患者死于脓毒症[1-2]。常见的 Sepsis 的发病与多种风险因素包括年龄、性别、遗传和削弱免疫系统的疾病(如癌症，糖尿病或缺乏脾脏)等有关[3] 。据报道，Sepsis 发生率正在上升且死亡风险较高，Sepsis 患者常常有长期的身体、心理和认知障碍，有重大的社会影响[4-5]。目前，对 Sepsis 的治疗方法包括给予适当的抗生素，必要时采取控制源措施，以及在需要时用静脉输液和血管活性药物进行复苏[6]。由于没有特定的抗 Sepsis 治疗方案，对患者的管理主要依赖于早期识别[7]。造成 Sepsis 治疗困难的主要原因在于我们对 Sepsis 的病理生理机制缺乏全面和深入的认识。

　　2. 脓毒症与线粒体功能障碍的联系

　　脓毒症本质上是一种机体自身免疫性损伤，其发病机制十分复杂，线粒体作为提供细胞能量的主要来源，以 ATP 形式为细胞提供 90%以上的能量。在脓毒症患者中，重要器官线粒体功能障碍，导致细胞生物能量不足，并可能发展为多器官功能衰竭，而多器官功能衰竭是引起脓毒症患者死亡的主要原因[8-9]。脓毒症导致线粒体功能障碍的可能发病机制包括微循环障碍、炎症介质的作用、细胞的氧化应激作用、NO 作用、线粒体 DNA 损伤以及各膜通道破坏等[10]。线粒体功能障碍在脓毒症发病机制中的作用也越来越受到人们关注。已有研究发现脓毒症引起的心肌线粒体结构和功能障碍会导致患者心肌细胞能量供应衰竭及凋亡[11]。脓毒症也可使肝细胞线粒体的结构和功能发生改变，进而引起肝细胞呼吸功能、三大营养物质代谢和解毒功能的障碍导致肝细胞的凋亡[12]。Hsieh C Y 仅发现脓毒症会减弱血管平滑肌收缩的合成代谢反应[13]。研究者还发现血管平滑肌中线粒体酶的复合物 I，III 和 IV 以及耗氧量在脓毒症中被显着抑制[14]。有关脓毒症患者血管平滑肌线粒体功能障碍的具体分子机制仍不清楚。但线粒体功能障碍是脓毒症患者出现多器官功能障碍综合征的原因之一，可以通过恢复线粒体结构和功能来寻找治疗脓毒症的药物。因此，进一步研究脓毒症的病理生理机制，寻找新的诊疗分子靶点就具有更加重要的理论价值和现实意义。

　　3. 脓毒症相关的 RAP1 信号通路简介 细胞信号转导异常与脓毒症发生、发展和预后的相关性研究一直在逐步深入。目前认为，脓毒症线粒体功能障碍引发的多器官功能障碍综合征可能与 RAP1 信号通路介导的活化蛋白激酶调控有关[15]。既往研究表明，激活 RAP1 信号通路主要通过调节脓毒症患者细胞内线粒体衍生的氧化应激对线粒功能障碍起调控作用[16]。作为脓毒症线粒体功能障碍的信号转导的一个环节，小 G 蛋白 Rap 是该通路的主要成分之一，对 RAP1 信号通路的调控发挥着关键作用[17]。在细胞中， Rap 通过结合 GTP 或 GDP 而发挥分子开关的作用，Rap 与 GTP 结合后处于激活状态，而当 GTP 被水解为 GDP 后，Rap 从激活态转为无活性的静息态[18]。此外，Rap 调控许多下游信号因子，如 Raf、ERKs、bax 等调节蛋白，影响线粒体氧化磷酸化过程以此介导细胞的迁移、粘附和凋亡过程引发疾病[19]。在探讨 RAP1 在脓毒症血管平滑肌线粒体障碍中的临床病理意义及细胞生物学功能过程中，人们发现 RAP1 可以起到调节线粒体功能障碍的作用。但是 RAP1 参与其中的具体分子机制缺乏系统的研究，所知甚少。

　　4. ITGAM 基因和脓毒症

　　整合素 αM(ITGAM)是形成异二聚体整合素 α-Mβ-2(αMβ2)分子的一种蛋白质亚基。αMβ2 在许多与先天免疫系统相关的白细胞表面表达，整合素 αMβ2 的 ITGAM(α)亚基直接参与引起细胞粘附和扩散，但不存在 β2(CD18)亚基则无法介导细胞迁移[20]。整合素介导的细胞粘附通过调节线粒体途径和死亡受体途径的活性来调节细胞凋亡[21]。已有研究表明，ITGAM 作为整联蛋白的亚基，介导酪氨酸激酶 Src 的活化，结合 Grb2-Sos 复合物引起 Rap 蛋白 GTP-GDP 交换而活化，活化的 Rap-Raf-MEKs 通路通过级联反应调控涉及细胞生长代谢的基因表达，可能介导线粒体的氧化磷酸化解偶联和产生氧化还原应激反应，使得线粒体功能障碍[22]。E Werner 研究发现整合素通过依赖于小 GTP 酶(Rap)介导的信号转导调控线粒体功能[23]。与此同时，研究发现线粒体功能障碍状态(产生反应性自由基和细胞氧化还原应激反应)能激活 Rap 信号通路[24]。在我们前期研究中已证实 ITGAM 在脓毒症患者血管平滑肌组织中表达量显著高于正常血管平滑肌，提示 ITGAM 在脓毒症患者血管平滑肌组织的高表达可能通过激活 Rap 信号通路启动下游靶基因的表达，对脓毒症患者血管平滑肌线粒体障碍产生影响。综上所述，ITGAM-RAP 信号通路为恢复脓毒症患者血管平滑肌线粒体障碍提供了一个新的思路，具有非常好的研究价值。但是 ITGAM 具体如何恢复脓毒症患者血管平滑肌线粒体障碍，及其具体机制如何还没有相关报道。

图 1 ITGA 参与 Rap1 信号通路介导脓毒症血管平滑肌线粒体功能障碍

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