实验设计方案套路6-LncRNA/miRNA/mRNA竞争结合型

前面已经介绍了5种实验设计方案套路，今天为科研朋友继续介绍一种，以LncRNA/miRNA/mRNA竞争结合型实验设计方案《LncRNA MIR155HG 和 lncRNA UCA1 作为 ceRNA 调控 EpCAM 影响前列腺癌上皮间质转化及侵袭转移的机制研究》为例，供大家参考学习!

　　LncRNA MIR155HG 和 lncRNA UCA1 作为 ceRNA 调控 EpCAM 影响前列腺癌上皮间质转化及侵袭转移的机制研究

　　1.1 前列腺癌和上皮间质转化

　　前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)是男性生殖系统常见的恶性肿瘤，在欧美国家前列腺癌是男性恶性肿瘤致死的主要原因之一[1]，在我国前列腺癌的发病率也呈逐年增长的趋势[2]。目前，手术及放化疗是前列腺癌治疗的常用方法，这些治疗在一定程度上对前列腺癌起作用，明显提高了患者的生存率，但对转移性前列腺癌仍缺乏有效治疗方法[3]。侵袭和转移是前列腺癌患者死亡的主要原因， 研究其相关的分子机制，可为前列腺癌的诊断和治疗提供新的方法，因此寻找调节前列腺癌侵袭转移的分子及机制对前列腺癌的治疗有重要意义。

　　上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是胚胎发育和器官发生过程中细胞重塑的关键过程，指上皮细胞表型失去其极化组织转变为具有侵袭转移能力的间质表型的生物学变化[4]，具体表现为上皮细胞标志蛋白减少， 而间充质细胞标志蛋白上调，细胞黏附能力下降，细胞外基质降解，获得干细胞特征等。有研究表明，非小细胞肺癌细胞通过EMT获得侵袭转移能力增殖能力、侵袭能力，并在系统迁移过程中通过逃避免疫系统产生转移的能力[5];EMT 通过下调维持细胞粘附作用的E-钙黏蛋白促使前列腺癌细胞侵袭和转移[6]。目前许多研究表明EMT通过细胞表型转换、分化，改变细胞粘附能力使细胞侵袭转移能力增强，是肿瘤细胞发生侵袭转移的关键环节[7]，但对其调控机制的认识仍然十分有限。前列腺癌是转移率和复发率极高的恶性肿瘤，因此了解调控肿瘤EMT的具体分子机制对于前列腺癌的防治意义重大。

　　1.2 上皮细胞粘附分子EpCAM与前列腺癌EMT

　　我们通过前列腺癌相关芯片筛选发现，上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)在前列腺癌中差异性表达(见工作基础)。EpCAM， 又名CD326，是一类分子量为40 Kd的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其过表达诱导TGF-β1介导鼻咽癌细胞的EMT和侵袭迁移[8]，也可通过PTEN/AKT/ mTOR信号通路促进乳腺癌细胞的EMT、侵袭和转移[9]，进而影响肿瘤的发生(见图1)。有研究表明EpCAM在EMT过程中为一种动态表达[10]，二者联系密切。由此我们可以引发思考，EpCAM在前列腺癌EMT中特定角色是什么?

　　图1 EpCAM调控EMT分子机制示意图

      EpCAM在各类正常上皮组织中的表达水平有所不同，但其表达均低于在肿瘤组织中的表达。有研究表明EpCAM在上皮衍生肿瘤中高表达，如在肺癌[11]、卵巢癌[12]、乳腺癌[13]、前列腺癌[14]等多种肿瘤组织中均具有较高的表达水平。我们在134例前列腺癌临床样本中对EpCAM表达进行了验证，相较癌旁组织，EpCAM在癌组织中高表达，具有显著差异性(见工作基础)。近年来，越来越多的研究表明EpCAM与肿瘤发生密切相关，如在肝癌中EpCAM主要引起肝癌细胞的复发、转移和预后[15];在前列腺癌中EpCAM在增殖、侵袭、转移过程中起着重要作用，可成为肿瘤抗原表达的候选标志物[16];EpCAM在体外通过PI3K / Akt / mTOR信号通路在前列腺癌的进展和化疗/放射抗性中发挥重要作用，可作为前列腺癌的潜在治疗靶标[17]。由上述可知，EpCAM在前列腺癌发生中发挥重要作用，可成为新的研究思路，但关于其上游调控机制尚未明确，由此我们推测可能存在某种microRNA调控EpCAM的表达进而影响前列腺发生?

　　1.3 miR-155-5p和miR-376a-3p可能通过调控EpCAM而影响前列腺癌EMT

　　miRNA(microRNA)是近年来发现的可在转录后水平调控的一类非编码小分子RNA，参与多种生理和病理过程，包括癌症侵袭、进展、转移和治疗性抵抗[18]。已有文献表明miRNA在肿瘤EMT及侵袭转移中发挥重要调控作用，如在结直肠癌中miR-146b-5p下调可以抑制EMT[19];miR-22通过抑制Snail和MAPK1/Slug/vimentin反馈环抑制膀胱癌细胞体内及体外的EMT[20]。在前列腺癌中，miR-15/miR-16的丢失和miR-21的获得均可异常激活TGF-β和Hedgehog信号传导，介导前列腺癌细胞的侵袭和骨质溶解[21];miR-193a-5p有效抑制体外前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭以及体内肿瘤生长 [22]。上述研究表明miRNA和肿瘤EMT和侵袭转移关系密切，在前列腺癌发生中也起重要作用，其在前列腺癌EMT 及侵袭转移过程中是否存在一定调控机制?为了寻找EpCAM的上游调控因子以及研究miRNA与EpCAM的调控关系，我们利用TargetScan、microRNA、RAID 等生物信息预测网站和软件筛选出与EpCAM存在结合位点的6个miRNA，通过qRT-PCR检测134例临床样本发现miR-155-5p和miR-376a-3p在前列腺癌中显著低表达，由此我们推测miR-155-5p、miR-376a-3p可能通过调控EpCAM的表达而影响前列腺癌中EMT及侵袭转移(见工作基础)。

　　有研究表明，在前列腺癌中 miR-155-5p 的下调与启动子甲基化显著相关[23]; 在胃癌中 miR-155-5p 表达下调，通过 Fas 信号通路参与 EMT 过程、细胞粘附调节和转移[24]。miR-155-5p 可以通过 EMT 影响口腔鳞状细胞癌转移[25];miR-376a-3p的低表达与前列腺癌较高的转移性事件发生率和较高的前列腺特异抗原相关[26];在骨巨细胞瘤中miR-376a-3p通过其靶基因COA1和PDIA影响巨细胞瘤基质细胞的肿瘤移植和进展[27]。以上研究表明miR-155-5p、miR-376a-3p在多种肿瘤中作为肿瘤抑制因子发挥作用，可调控包括前列腺癌在内的多种癌细胞转移，与我们在前列腺癌中发现的低表达趋势一致，其是否可能通过EpCAM 影响前列腺癌EMT和侵袭转移将有待进一步证实。目前关于miR-155-5p、miR-376a-3p参与的ceRNA机制尚未见报道，为进一步清楚miRNA的调控上游， 我们推测是否存在某种长链非编码RNA可作分别作为这两种miRNA的ceRNA共同调控前列腺癌的发展?

　　以上只截取了一小部分内容，如果想要知道关于《LncRNA MIR155HG 和 lncRNA UCA1 作为 ceRNA 调控 EpCAM 影响前列腺癌上皮间质转化及侵袭转移的机制研究》完整的实验设计方案内容可以点击这里下载资料包，里面有详细的分子机制图和技术路线图哦!