实验设计方案套路5-CircRNA介导信号通路型

前面已经介绍了4种实验设计方案套路，今天为科研朋友继续介绍一种，以CircRNA介导信号通路型实验设计方案《环状RNAHsa-circRNA7044介导miR-132在癫痫中的调控机制》为例，希望可以帮到大家。文末有详细的资料包，需要的朋友可以点击下载!

　　环状RNAHsa-circRNA7044介导miR-132在癫痫中的调控机制

　　1.1 癫痫与其发病机制

　　癫痫(Epilepsy)即俗称的“羊角风”或“羊癫风”，是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病[1]。癫痫发作是大脑皮层过度和异常神经元活动的结果[2]。截至 2015 年，约有 3900 万人患有癫痫[3]。近 80%的案例发生在发展中国家。常见的 epilepsy 的发病与多种风险因素包括年龄、性别、遗传和其他强制性外因(如烟酒戒断、电解质问题) 等有关[4-5] 。据报道，Epilepsy 导致的死亡人数从 1992 年的 112000 人上升到 2015 年的 125000人，Epilepsy 频繁发作常常导致患者身心、智力受损，有重大的社会影响 [6]。Epilepsy 的诊断主要是通过对大脑进行成像即脑电图(EEG)并进行血液检测来确认 [7]。目前国内外对于Epilepsy 的治疗主要以药物治疗为主，辅以手术、神经治疗或饮食改变等[8-9]。但是仍然缺乏特定的治疗方案，造成 Epilepsy 治疗方案缺乏的主要原因在于我们对 Epilepsy 的病理生理机制缺乏全面和深入的认识。

　　癫痫发病的确切生理机制尚不清楚。常见癫痫病例是由于脑损伤，中风，脑肿瘤，脑部感染、基因突变以及通过一种称为癫痫发生过程的出生缺陷而发生的[10]。癫痫症状发生时通常脑电活动是非同步的，会产生称为阵发性去极化转变的去极化波[11]。它的活性受到神经元和细胞环境中各种因素的调节。神经元内的因素包括离子通道的类型，数量和分布，受体的变化以及基因表达的变化[12]。神经元周围的因素包括离子浓度，突触可塑性和神经胶质细胞对发射器分解的调节 [13]。癫痫的其中一种机制表现为兴奋性神经元抵抗力下降，产生兴奋性神经元内的电变化以及腺苷的负面影响，这可能是由于离子通道或抑制性神经元功能不正常而发生的[14]。癫痫的另一种机制可能是上调兴奋性回路或下调大脑受伤后的抑制回路[15]。血脑屏障的失败也可能是一种因果机制，因为它可以使血液中的物质进入大脑[16]。有关癫痫患者发病的具体分子机制仍不清楚。但神经元内离子通道障碍是癫痫发生的主要原因之一，可以通过深入研究脑神经元离子通道障碍涉及的通路基因来寻找治疗癫痫的药物。因此，进一步研究癫痫发病的生理机制，能为治疗改善癫痫病症提供新思路。

　　1.2 miR-132 与癫痫病症

　　微小 RNA(microRNA，miRNAs)，miRNAs 是参与基因的转录调控、转录后调控和翻译后调控的重要环节[17]。miRNAs 是一类在人体广泛分布的内源性非编码 RNA，由含有约70-90个碱基大小的发夹结构单链RNA前体经过酶加工后生成，这种方式是身体调节基因表达的一个重要策略。miRNAs 主要通过与靶 mRNA 的 3'端非翻译区(untranslated region，UTR)结合，导致其翻译过程受到抑制或者引起靶 mRNA 的降解，在转录后水平特异性影响靶基因表达，并通过此机制调控大约 30%人体基因组编码的蛋白质表达[18-20]。

　　关于 miRNA 在癫痫中的功能研究陆续有报道。有研究比较大鼠癫痫持续状态与对照大鼠时，发现 miRNA-187-3p 靶向钾通道蛋白 KCNK10 / TREK-2 在癫痫模型的慢性期中上调。对癫痫症状可能有缓解作用[21]。新兴研究表明，miRNA 在调节参与癫痫的炎症途径中具有重要作用。这些 miRNA 可能可以作为治疗癫痫的新型治疗靶点，也可以作为癫痫发生的诊断性生物标志物[22]。有研究表明使用反义寡核苷酸沉默大脑特异性 miR-134 在动物模型中具有强效抗痉挛作用，而miR-128 的遗传缺失在大鼠中产生致命性癫痫。相关功能研究表面miRNA通过靶向转录因子，神经递质信号成分和神经炎症调节剂似乎影响癫痫发作或海马病理[23]。

　　我们通过癫痫基因芯片和组织学观察筛选出表达具有显著差异的 miR-132。miR-132 来自位于大鼠染色体 11 上的非编码基因的内含子中的 miR-212/132 簇。已发现 miR-132 的几个靶标，包括神经发育，突触传递，炎症和血管生成的介质。有研究表明 miR-132 水平在癫痫发作后增加，这强烈表明神经元异常活化和 miR-132 转录之间的因果关系[24]。为了研究与炎症有关的 miR-132 动态表达模式，对未成熟癫痫大鼠的海马进行了 qRT-PCR 发现 miR-132 在不同阶段具有不同表达模式可能暗示其在癫痫发病机制中的不同功能[25]。Jinxian Yuan[26]等提出miR-132 和 p250GAP 可能通过激活下游 Rho GTPase 家族在癫痫发生过程中发挥重要作用。虽然关于 miR-132 在癫痫的功能研究陆续有发现，但 miR-132 对于癫痫的具体发生机制尚不十分明确。

　　1.3 Hsa-circRNA7044 与痫病症

　　除了 miRNA 以外，环状 RNA(circRNA)在基因的各个调控环节也发挥重要作用。由于circRNA 不具有 5'或 3'末端，缺少聚腺甘酸的尾部，因此对外切核酸酶介导的降解具有抗性， 与细胞中大多数线性 RNA 相比更稳定[27]。Salmena 等人首次提出了 CeRNA 假说[28]，认为mRNA、circRNA 等转录物可作为 CeRNA 通过与 miRNA 应答元件(miRNAresponseelement，MRE)竞争性结合来调控基因的表达水平。随后，Cesana、Karreth 和 Sumazin 等人分别从细胞生物学、动物模型和生物信息学等不同水平来进一步的研究 CeRNA 的调控假说，并证实了CeRNA 调控机制[29-31]。随着 CeRNA 假说的发展，circRNA 和miRNA 作为竞争性内源RNA在癫痫发生发展中起到了重要的作用，并成为了研究的热点。

　　有研究表明，circRNA 在脑组织细胞质中异常富集，特别是在神经细胞和树突中，并且可能参与调节突触功能和神经可塑性[32]。这些特征表明，circRNA 可以在神经系统疾病如癫痫，帕金森病(PD)和阿尔茨海默病(AD)中起重要作用。同时这些研究为阐明癫痫脑电活动异常等生物学行为的调控机制提供了新思路。 有研究表明，CDR1as 的 CircRNA 和 AD 功能缺陷可以上调 miR-7 的表达，并可能导致泛素蛋白连接酶等相关靶标下调; 同时 miR-7 可以下调 α-突触核蛋白的表达影响蛋白的高神经元表达高度涉及 PD 的发病机制[33]。根据生信分析显示 circ-EFCAB2 与 miR-485-5p 结合以增加离子通道 CLCN6 的表达水平，而 circ-DROSHA 与 miR-1252-5p 相互作用以降低ATP1A2 的表达水平。说明 circRNAs 失调可能反映癫痫出的发病机制，circRNAs 可能为找寻癫痫患者的潜在治疗靶点和生物标志物提供理论依据[34]。但 CircRNA 功能及其与癫痫病症的关系尚未完全阐明，有些问题尚待解决。由于 circRNA 在体内的丰富性和稳定性，它们可能是未来有用的临床诊断生物标志物。同时，circRNAs 对基因的调控作用可被视为治疗目标。

　　我们通过癫痫基因芯片筛选的 Hsa-circRNA7044 是一种新型的环状 RNA，目前有关该circRNA 在癫痫中的研究还没有发现，而我们在前期研究中，通过基因芯片分析发现 miR-132 在癫痫患者中显著高表达，利用生物信息学方法结合癫痫相关芯片数据 GSE74048 筛选发现， Hsa-circRNA7044 是癫痫中表达显著上调的环状RNA。通过MEM 网站，发现Hsa-circRNA7044 和 miRNA-132 具有靶向关系(见研究基础)。综上所述，可以假设 miR-132 环状 RNA Hsa-circRNA7044 通过竞争性结合 miR-132 参与癫痫的发生，为寻求新的新的治疗方案提供了新思路，具有很好的研究价值。

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