实验设计方案套路4-LncRNA甲基化修饰型

本文以LncRNA甲基化修饰型实验设计方案《LncRNA Gas5 的m6A 修饰在宫颈鳞状细胞癌中的作用机制》为例为科研朋友们介绍如何写实验设计方案，供大家参考学习!文末有详细的资料包，需要的朋友可以点击下载!

　　LncRNA Gas5 的m6A 修饰在宫颈鳞状细胞癌中的作用机制

　　1.1 CESC 与 m6A 修饰

　　宫颈癌是全球女性中第四大常见癌症，癌症死亡的第二大原因，每年导致275,000 人死亡[1]。在中国，宫颈癌在所有女性癌症发病率中排名第八，是 15-44 岁妇女中第二大常见癌症[2]。根据组织学特征，大多数浸润性宫颈癌可分为鳞状细胞癌(SCC，squamous cell carcinoma)，腺癌(AD，adenocarcinoma)，或腺鳞癌(ASC，adenosquamous cell carcinoma)。其中宫颈鳞状细胞癌(CESC，cervical squamous cell carcinoma)为最常见的组织学亚型之一[3]。目前根据肿瘤分级和肿瘤大小对宫颈癌患者采取不同的治疗方法，常用方法有根治性子宫切除术、盆腔淋巴结清扫术和放化疗[4, 5]。SCC 的发病率在东南亚和中亚最高，其中 79%的SCC 病例发生在东南亚和中亚[6]。因此寻找宫颈癌的新的治疗靶点以及研究宫颈癌的病理机制对宫颈癌有重要的临床指导意义。

　　癌症的发生发展是一个多因素的过程，除基因重组、突变等传统遗传修饰之外，DNA 和组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化等表观遗传修饰同样重要。表观遗传学是指在不改变 DNA 序列的情况下通过改变基因结构调控基因表达, 不同于 DNA 序列突变的是，表观遗传的改变是可逆的，这为癌症等疾病的治疗提供了新方向[7]。此外，细胞 RNA(mRNA, tRNA, snRNA 等)在不同的位点上也有数百个转录后修饰，作为癌症进展中表观遗传失调的重要分支，“RNA 表观遗传学”正在成为新的研究前沿[8]。

　　本课题中，我们重点研究了 RNA 表观遗传学中的 N-6 甲基腺苷(m6A)修饰。N6 -甲基腺苷(m6A)是发生在 mRNA、长链非编码 RNA 等 RNA 的腺嘌呤(A)上的甲基化修饰。已有研究发现 m6A 修饰与 Kaposi 肉瘤相关疱疹病毒呈阳性的肾癌细胞周期相关[9]。随着基于抗体的测序技术的发展以及与 m6A 相关的"writer"、"eraser"和"reader"的发现，我们逐步观察到 m6A 和 mRNA 代谢之间的关系。已有研究证明 m6A 在调节 RNA 稳定性[10]和 RNA 剪接[11]、mRNA 的翻译效率中起关键作用[12]。

　　1.2 m6A 修饰与肿瘤进程

　　m6A 还可参与调控各种生物过程，如细胞命运控制，早期胚胎发育，性别决定以及糖尿病和肥胖等疾病[13]。最近，越来越多的研究发现 m6A 与癌症有关， 有助于癌症干细胞的自我更新，促进白血病发生、癌细胞增殖，以及对放疗或 化疗的抵抗力等[14,15]。据 2017 年 Cancer Letters 刊文报道：甲基转移酶样 3 通过m6A 修饰参与 RNA 代谢，并抑制肿瘤抑制因子 let-7g 以促进乳腺癌的进展[16]。Qi Cui 和他的团队发现 m6A 修饰在胶质母细胞瘤干细胞(GSC)自我更新和肿瘤发生中起重要作用[17]。但未见 m6A 修饰在宫颈癌中作用的相关研究，因此研究 CESC 中的 m6A 修饰具有创新性。

　　我们对 5 组 CESC 样本的 mRNA 的 m6A 水平进行了检测，发现相比于正常组，CESC 组中 m6A 水平显著升高。由此我们猜测 m6A 可能参与 CESC 的发生发展过程，但 lncRNA Gas5 的 m6A 修饰是否与 CESC 相关仍不清楚。

图 1 m6A 修饰发生过程的假说图

　　1.3 lncRNA Gas5 的 m6A 与 CESC

　　除 mRNA 外，非编码 RNA 也受 m6A 调控[18]，其中 LncRNA 在转录和转录后调控中起着关键作用。有研究发现，m6A 修饰通过改变 mRNA 和 lncRNA 中的局部结构以促进异源核核糖核蛋白 C 的结合，从而调节 RNA-蛋白质相互作用[19]。此外，还有研究发现 m6A 修饰起到破坏 lncRNA 结构的触发作用从而调控癌细胞增殖和侵袭[20]。

　　王俊义等人预测发现并证实 lncRNA Gas5 与肝细胞癌，纤维化，肾脏疾病和肺癌显著相关[21]。另外，lncRNA Gas5 在胶质瘤中通过下调 miR-222 抑制肿瘤发展[22]。在膀胱癌中 lncRNA Gas5 通过抑制 EZH2 转录促进膀胱癌细胞凋亡[23]。在肺腺癌中 lncRNA Gas5 通过下调 IGF-1R 表达抑制肿瘤发展[23]。但还未见lncRNA Gas5 与宫颈癌的相关报导。

　　为深入了解 lncRNA Gas5 在 CESC 中的作用，我们通过对癌症基因组图谱(TCGA)数据库中数据分析，发现与正常组织相比，lncRNA Gas5 在 CESC 患者样品中显著低表达，并且经检测 145 组临床样本数据我们发现lncRNA Gas5 在 CESC 中显著下调，lncRNA Gas5 为 CESC 中显著低表达的长链非编码 RNA。通过 m6AVar 数据库分析显示，lncRNA Gas5 上存在一个 m6A 修饰位点，且该m6A 修饰位点恰好存在于 lncRNA Gas5 和 miRNA 的结合区域。分析所有可以靶向 LNCRNA GAS5 的 miRNA，做出列表，其中包含 miR-455-5P。发现 lncRNA Gas5 上 m6A 修饰位点处与 lncRNA Gas5 结合的 miRNA 为 miR-455-5P(见工作基础)。由此我们提出大胆猜想：m6A 甲基化的发生可能影响LncRNA-miRNA互作。但 lncRNA Gas5 与 miR-455-5p 的具体互作方式尚不明确。

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