提取RNA及用DEPC去除RNase的实验经验

 Rnase是一种蛋白酶，能够降解RNA。 这个酶高效稳定。要么在DEPC水中处理n小时，要么在160度高温烘烤6小时。此酶才会失效。所谓DEPC，是一种叫做焦碳酸二乙酯的东西。所谓DEPC水，一般指两种状态，a，配制好未消毒;b，配制好已消毒。通过高压消毒，该物质会降解，从而无毒。

　　提取RNA所用的枪头，EP管。直接高压烘干即可。如果用0.1%DEPC处理，要在DEPC配置后振摇1小时后再浸泡枪头，EP管方有效。我做的都是将枪头泡在配制好的depc中，摇振过夜，然后倒掉depc注意要到干净，再高压，为了防止仍残留液体可120度干烤一会。

　　A.对于提取RNA来说,我认为关键的一点在于实验器材的准备.包括从最初的标本的制备,保存,以及之后的试剂的准备,匀浆器,镊子,tip头的去除RNase处理,尤其是去除RNase的DEPC处理步骤。

　　B.您在处死大鼠前,先准备好干净的冻存管(用1.5ml的Ep管也可以,就是后面您在从液氮中取出的时候容易爆,您的注意安全),然后将去除的骨骼肌立即用干净的剪刀分成半颗到一颗黄豆大小,装入冻存管后立即投入液氮保存.个人认为在这里使用装标本的管子没必要用DEPC处理。

　　C.在提取RNA之前,将试剂(TRIzol)和器械(tip头,镊子,匀浆器)都准备好。

　　D.从液氮取出标本后,立即转移进入事先加入TRIzol的匀浆器内(最好置冰上操作),立即匀浆,一直到标本完全碾磨碎,这个时候TRIzol液体成浑浊状,而且匀浆器的壁上没有太多的黏附组织,然后将TRIzol转出,继续后续的步骤。

　　无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC)，室温搅拌4小时以上至完全溶解，高压灭菌20分钟，冷却备用。这个是DEPC水的b状态。

　　如果你要用DEPC水处理Tips等等东东，那么就要用高压前的水，即DEPC水的a状态。把枪头管子等完全浸泡至少8小时，我一般都是过夜的，或者平时就泡在里面备用。

　　RNA提取必须创造无RNase的环境，所有仪器与试剂均按照以下方法进行处理 ：研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在180℃烘干4h以上; 电泳槽、胶板、梳子、用0.1 %～0.2%DEPC水处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用0.5%的SDS (Sodium dodecyl sulfate，抑制RNase的活性)浸泡过夜，然后用ddH2O冲洗干净，晾干备用;离心管，枪头等塑料器皿要用0.1%～0.2%DEPC水处理之后(DEPC有致癌之嫌，须小心操作)。37℃保温12h以上，然后高压灭菌，灭活DEPC ( Diethypyrocarbonate );溶液都需用经DEPC处理过的水配置， RNA提取的所有操作应尽可能在超净工作台上进行。

　　有灭菌过的DEPC水，这一般是用来配75%乙醇用，因为乙醇若高压灭菌会挥发，所以乙醇是新开封专用的。

　　没有经高压灭菌的DEPC水，这主要是用于配你提RNA所用的其他试剂(所说的试剂是可以经高压灭菌的)，总的来说，都得经过高压灭菌，目的就是要去除DEPC，以防止它以随后实验的干扰。

　　DEPC处理水：无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC)，室温搅拌4小时以上，121 度高压灭菌20分钟，冷却备用。

　　凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。

　　为什么在28s之后还是有影影约约的片断和模糊的smear?这都与非变性电泳方式有关。RNA 的电泳，严格讲是要使用变性电泳的，我们平时所知道的 RNA 电泳的知识，实际上都是由变性电泳获得的。但因为非变性电泳实在是太方便了，同时，就一般检测而言，完全可以替代变性电泳，所以我们日常检测就都使用非变性电泳了。

　　电泳时间太长了容易产生降解。最好是在120V左右。操作的时候有没有注意戴口罩和手套，注意，手套要经常换，不要太节约了。那样也会影响RNA的质量。无论你是提什么RNA只要是用异丙醇沉淀的，都得用75%的酒精洗涤一次。

　　1、 样品不要太多，抽提务必充分，室温放置5min;

　　2、 200ul氯仿 剧烈振荡20s，室温放置2-15min;

　　3、13000g 离心 15min;

　　4、取上层水相,一般400-450ul就足够了;

　　5、加入500ul异丙醇 摇匀，室温放置10min;

　　6、12000g 离心 10min;

　　7、75%乙醇 1000ul 洗涤沉淀;

　　8、7500g 离心 5min;(12000转速太高了吧，沉淀不容易溶解的)

　　9、弃乙醇，吸干净残余的微量乙醇， 室温干燥3-5min;(时间太久沉淀不易溶解)

　　10、 适量DEPC水溶解沉淀。

　　电泳的上样量1ug，电泳buffer用DEPC处理的水配制，电泳时间不要太久，95V，10-15min足够了。建议跑RNA电泳。先用2%琼脂糖胶，若分离效果不好，可用甲醛变性胶。在上样缓冲液中注意加入RNA酶抑制剂。注意观察带形，质量较好的RNA亮度 。28S:18S应为2:1。还要注意观察，在加样孔或刚出加样孔附近，有没有带， 若有，可能为基因组DNA污染。 OD值只有1.5，可能为基因组DNA污染。参考一下分子克隆3。上面有OD值与 污染DNA的关系。建议，酚氯仿抽提后，上清可少吸一些。提取后的RNA样品可用无RNA酶的DNA酶消化一下。注意该酶的buffer中有一种物质在OD260有吸光度，应严格按照其protocol操作，减少误差。

　　只要用DEPC处理过的水，打开一瓶新的无水乙醇(或者专用于RNA的，即只用处理过的枪头取过乙醇的)配就可以了。DEPC高温高压时变成CO2和水，再加上乙醇也很容易气化，可能是因为有气体产生吧，如果盖子太紧容易发生瓶子破掉的事情。而且，湿热灭菌本身不足以去除RNA酶，灭菌可能反而引入RNA酶污染也不一定。

　　75%的乙醇用于提取RNA 时最好还是现用现配，乙醇最好是新的且以后不要用于其他方面，也就是留一瓶专门用于提取RNA。DEPC一般高压灭菌30分钟就可以了。

　　75%乙醇：灭菌后的千分之一DEPC水25ml+75ml无水乙醇.配好后装入高温烘烤的玻璃瓶中(160干烘四小时)，或塑料器皿的用千分之一的DEPC泡12小时以上再灭30分钟，存放于低温冰箱4度保存。