用TUNEL实验方法检测细胞凋亡

细胞凋亡是指由基因控制的细胞自主和有序死亡，以维持体内平衡。细胞凋亡与细胞坏死不同。细胞凋亡不是一个被动的过程，而是一个活跃的过程。它涉及一系列基因的激活、表达和调控。它不是病理条件下的自身损伤现象，而是积极争取更好地适应生活环境的一种死亡过程。下面介绍一种检测细胞凋亡的实验方法——TUNEL法。

　　TUNEL法检测细胞凋亡的实验方法原理：

　　脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。

　　毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1%，若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。

　　实验材料：组织切片、冰冻切片、细胞

　　试剂、试剂盒：磷酸缓冲液、蛋白酶K、氯化钴盐、蒸馏水、双氧水、二氨基联苯、丁醇、乙醇、二甲苯、甲醛、乙酸、松香水、抗地高辛抗体、氯化钠、柠檬酸钠、乙酸钠、甲基绿、TdT酶反应液

　　仪器、耗材：组织切片、冰冻切片、细胞

　　试剂、试剂盒：磷酸缓冲液、蛋白酶K、氯化钴盐、蒸馏水、双氧水、二氨基联苯丁醇、乙醇、二甲苯、甲醛、乙酸、松香水、抗地高辛抗体、氯化钠、柠檬酸钠、乙酸钠、甲基绿、TdT酶反应液

　　仪器、耗材：光学显微镜、染色缸、载玻片、盖玻片

　　实验步骤：

　　一、试剂配制

　　1. 磷酸缓冲液PBS(pH7.4)：磷酸钠盐 50 mM，NaCl 200 mM。

　　2. 蛋白酶K(200 μg/ml，pH7.4)：蛋白酶K 0.02 g;PBS 100 ml。

　　3. 含2%H2O2的PBS缓冲液(pH7.4)：H2O2 2.0 ml;PBS缓冲液 98.0 ml。

　　4. TdT酶缓冲液(新鲜配)：Trlzma碱 3.63 g用 0.1 N HCl调节pH至 7.2，加ddH2O定容到1 000 ml;再加入二甲砷酸钠 29.96 g和氯化钴0.238 g。

　　5. TdT酶反应液：TdT酶32 μl;TdT酶缓冲液 76 μl，混匀，置于冰上备用。

　　6. 洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17. 4 g;柠檬酸钠 8.82 g;ddH2O 1 000 ml。

　　7. 0.05%二氨基联苯(DAB)溶液：DAB 5 mg;PBS 10 ml，pH7.4，临用前过滤后，加过氧化氢至0.02%。

　　8. 0.5%甲基绿(pH4.0)：甲基绿0.5 g;0.1 M乙酸钠100 ml。

　　9. 100%丁醇，100%、95%、90%、80%和70%乙醇，二甲苯，10%中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

　　10. 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(ONCOR)。

　　二、实验步骤

　　1. 标本预处理

　　(1)石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5 min。用无水乙醇洗两次，每次3 min。用95%和75%乙醇各洗一次，每次3

　　min。用PBS洗5 min 加入蛋白酶K溶液(20 ug/ml)，于室温水解15 min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2 min，然后按下述步骤2进行操作。

　　(2)冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10%中性甲醛中，于室温固定10 min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5 min。置乙醇：乙酸(2：1)的溶液中，于-20℃处理5 min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5 min，然后按下述步骤2进行操作。

　　(3)培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 107个/ml细胞于 4%中性甲醛室温中固定10 min。在载玻片上滴加 50-100 μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5 min，然后按下述步骤2进行操作。

　　2. 色缸中加入含2%过氧化氢的PBS，于室温反应5 min。用PBS洗两次，每次5 min。

　　3. 用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1-5 min。

　　4、 用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54 μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1 h(注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液)。

　　5. 将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30 min，每10 min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。

　　6. 组织切片用PBS洗3次，每次 5 min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30 min。

　　7. 用PBS洗4次，每次5 min。

　　8. 在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05% DAB溶液，室温显色3-6 min。

　　9. 用蒸馏水洗4次，前3次每次1 min，最后1次5 min。

　　10. 于室温用甲基绿进行复染10 min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30 s。依同样方法再用100%正丁醇洗三次。

　　11. 用二甲苯脱水3次，每次2 min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。

　　三、注意事项

　　1. 诱导培养HL-60细胞时间要准确;

　　2. 荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。