染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验步骤详解

染色质免疫共沉淀技术的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。这项技术主要用来分析目标基因有没有活性、或者分析一种已知蛋白(转录因子)的靶基因有哪些。下面小编分享一些关于色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结的详细介绍，供大家参考!

　　ChIP 实验原理

　　在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

　　可以利用 ChIP研究转录因子(transcription factor, TF)与启动子( promoter )的关联性。由于 ChIP 采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF 与 Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸(DNA 或 RNA )之间会产生共价键。细胞内， 当 TF 与 Promoter 相互结合 (生物意义上的结合)时，它们必然靠的比较近， 或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

　　一般 ChIP 的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA 复合物相互结合——加入 Protein A ，结合抗体-靶蛋白-DNA 复合物，并沉淀 ——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA 复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断—— PCR 分析。

　　ChIP 实验步骤具体如下：

　　第一天：

　　(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。

　　1、取出 1 平皿细胞( 10cm 平皿)，加入 243ul 37 %甲醛，使得甲醛的终浓度为 1%。(培养基共有 9ml )

　　2、37 摄氏度孵育 10min。

　　3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为 0.125M 。450ul 2.5M 甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置 5min 即可。

　　4、吸尽培养基，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。

　　5、细胞刮刀收集细胞于 15ml 离心管中(PBS 依次为 5ml ，3ml 和 3ml )。预冷后 2000rpm 5min收集细胞。

　　6、倒去上清。按照细胞量，加入 SDS Lysis Buffer 。使得细胞终浓度为每 200ul 含 2×106 个细胞。这样每 100ul 溶液含 1×106 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设 MCF7 长满板为 5×106 个细胞。本次细胞长得约为 80%。即为 4×106 个细胞。因此每管 加 入 400ul SDS Lysis Buffer 。将 2 管混在一起，共 800ul 。

　　7、超声破碎： VCX750 ， 25%功率， 4.5S 冲击， 9S 间隙。共 14 次。当然，如果实验室有Bioruptor 这种神器的话那就轻松了。

　　(二)、除杂及抗体哺育。

　　8、超声破碎结束后， 10， 000g 4 度离心 10min 。去除不溶物质。留取 300ul 做实验，其余保存于-80 度。300ul 中， 100ul 加抗体做为实验组; 100ul 不加抗体做为对照组; 100ul 加 入 4ul 5M NaCl(NaCl 终浓度为 0.2M )， 65 度处理 3h 解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

　　9、在 100ul 的超声破碎产物中，加入 900ul ChIP Dilution Buffer 和 20ul 的 50×PIC。再各加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 。4 度颠转混匀 1h。

　　10、 1h 后，在 4 度静置 10min 沉淀， 700rpm 离心 1min 。

　　11、取上清。各留取 20ul 做为 input 。一管中加入 1ul 抗体，另一管中则不加抗体。 4 度颠转过夜。

　　(三)、检验超声破碎的效果。

　　取 100ul 超声破碎后产物，加入 4ul 5M NaCl ， 65 度处理 2h 解交联。分出一半用酚 /氯仿抽提。电泳检测超声效果。

　　第二天：

　　(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。

　　12、孵育过夜后，每管中加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 。4 度颠转 2h。

　　13、 4 度静置 10min 后， 700rpm 离心 1min 。除去上清。

　　14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在 4 度颠转 10min ，4 度静置 10min 沉淀， 700rpm 离心 1min ，除去上清。

　　洗涤溶液： a. low salt wash buffer----one wash

　　b. high salt wash buffer-----one wash

　　c. LiCl wash buffer------one wash

　　d. TE buffer------two wash

　　15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方： 100ul 10 % SDS， 100ul 1M NaHCO3 ， 800ul ddH2O ，共 1ml 。每管加入 250ul 洗脱 buffer ，室温下颠转 15min ，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管 500ul 。

　　16、解交联：每管中加入 20ul 5M NaCl (NaCl 终 浓 度为 0.2M )。混匀，65 度解交联过夜。

　　第三天：

　　(一)、DNA 样品的回收

　　17、解交联结束后，每管加入 1ul RNaseA ( MBI )， 37 度孵育 1h。

　　18、每管加入 10ul 0.5M EDTA ， 20ul 1M Tris.HCl ( PH 6.5)， 2ul 10mg/ml 蛋白酶 K。45 度处理 2h。

　　19、 DNA 片段的回收 ――― omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于 100ul ddH2O 。

　　(二)、PCR 分析

　　ChIP 技术总结

　　(一)关于细胞

　　细胞的生长状态要好。 因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络， 也很有

　　可能影响你所研究的 TF 与其靶 Promoter 的结合。一般细胞长到 75%- 80%比较好。

　　(二)关于抗体

　　抗体是实验成败的致命因素之一!必须是 IP 级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和 santa cruz 的抗体，即使是 IP 级别的。

　　单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。 两种抗体各有利弊。 单抗特异性强，背景低。 但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在 ChIP 甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭， 导致单抗不能识别靶蛋白。 多抗虽然没有这个问题， 但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。

　　一般而言，如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域) ，选择多抗比较稳妥一些。

　　(三)关于交联与超声破碎

　　这一块的确是 ChIP 实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。

　　交联不充分，只有一部分靶蛋白与其 Promoter 相结合，富集得到的 Promoter 的量不高，实验假阴性。 交联过充分， 基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。

　　一般来讲，按照经验，交联条件取决于细胞类型。 不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如： NIH - 3T3 的交联条件是室温( 25 摄氏度)下 15min ， 1%的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor 这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是 200bp- 1000bp。但是 200bp- 2000bp 的范围也是可以接受的。

　　(四)关于操作

　　希望尽可能的保持低温( 4 度)。沉淀的时候可以先在 4 度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速( 500rpm 等)离心使其完全沉降。虽然说明书上说 ChIP 实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到 PCR 结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

　　(五)关于解交联

　　虽然说明书上说 4 小时已经足够， 但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA 不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在 EP 管口封上封口膜。

　　(六)关于 DNA 片段的回收

　　需要注意的是：样品中 SDS 样品较高，普通的 PCR 产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入 SDS，影响 PCR 实验结果。小 Tip ：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除 SDS 沉淀。

　　以上就是关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验步骤的详细介绍，现在染色质免疫共沉淀技术主要应用于组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”、转录调控分析、.药物开发研究、有丝分裂研究、DNA损失与凋亡分析等。如果想要了解更多实验技术内容可以到本站与科研大咖们一起探讨，共同进步!